Producción del extracto crudo de bacteriocinas a partir de L. Plantarum LPBM10. La cepa nativa de L. plantarum LPBM10 fue suministrada por el Laboratorio de Microbiología Industrial de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. Un inoculo inicial de 106 UFC/mL del L. plantarum LPBM10, fue cultivado en caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe) a 30 °C por 48 horas a 150 rpm en un agitador horizontal (Incubator Shaker, InnovaTM 4400, 2000, New Brounswick Scientific co. Inc, NJ, USA), simulando condiciones de anaerobiosis.
Posteriormente centrifugado a 4 °C y 10000 rpm durante 20 minutos (8). El sobrenadante fue esterilizado por filtración por membrana (Milipore, poro 0,45 piml diámetro 47 mm) y luego fue calentado a 80° C durante 10 minutos. Finalmente el sobrenadante libre de células o extracto crudo de bacteriocinas fue neutralizado con NaOH 0.1 N (9, 10). La cantidad de proteína producida por el lactobacillus plantarum LPBM10 contenida en el extracto crudo fue medida por el método de Bradford. Determinación de la actividad del extracto crudo de bacteriocinas. La determinación de la actividad del extracto crudo de bacteriocinas producido por el Lactobacillus plantarum LPBM10 fue evaluada sobre E.coli, por el método de difusión por disco. El microorganismo fue inoculado sobre cajas de petri con agar nutritivo por el método de superficie, posteriormente, fueron colocados los discos de papel filtro en el medio de cultivo impregnados con 20 uL del extracto crudo de bacteriocinas e incubados a 30 oC durante 24 horas. La actividad antibacteriana fue comprobada por la presencia de halo inhibitorio alrededor de los discos.
http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S0717-75182009000300005&script=sci_arttext
Prueba de actividad inhibitoria
Antes de realizar estos ensayos, se llevaron a cabo pruebas para verificar la viabilidad y la pureza de las cepas. Las pruebas de actividad antimicrobiana se realizaron con cada una de las cepas BAL aisladas, utilizando la técnica de la doble capa. Las cepas viables y puras, fueron sembradas en agar MRS. De cada cepa se seleccionó una colonia y se sembró en un tubo conteniendo 5 mL de caldo MRS modificado y se incubó por 18 h a 25°C Se seleccionó una colonia y se sembró en un tubo conteniendo 5 mL de caldo MRS modificado y se incubó por 18 h a 25°C . Transcurrido este tiempo, se vaciaron 15 mL de agar MRS modificado en cajas Petri, una vez solidificado se dividió el fondo de la placa en cinco segmentos iguales y se depositó cuidadosamente en cada segmento una gota de 1.5 mL de cada caldo de cultivo de la BAL a ensayar, a una distancia suficiente para evitar su confluencia. Se dejó secar unos minutos en campana de flujo laminar y se incubaron a 25°C por 24 h. Una vez crecidas las colonias, en la superficie central del agar se colocó un sensidisco con 7 mL de antibiótico como testigo positivo de la prueba inhibición y toda la superficie del agar se cubrió con una sobre capa de 10 mL de agar Soya Tripticaseína suave (1%), que fue previamente inoculado con 20 mL del microorganismo patógeno y se dejó solidificar durante 20 minutos. Las placas se incubaron por 24 h a 37°C. El efecto antibacteriano se detectó por la presencia de halos de inhibición mayores a 1 mm alrededor de las colonias de BAL.
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